李冠廷中国式共享经济，消耗超1000亿，几乎全军覆没-时局文摘

李冠廷
来源：海哥商业观察
共享是个筐，啥都往里装！
中国的投资人、创业者，是世界上最神秘的一股力量。指哪儿打哪儿，要谁好谁就好，要谁亡谁就亡。
过去两年最火的共享经济，就拜他们所赐，把一些企业捧上了天，待搜刮完红利、薅完羊毛，然后再把它们狠狠的摔在地上。以共享之名，行抢劫之实，创虚假繁荣，造资源浪费。一地鸡毛、满目苍夷。
这不是耸人听闻，也不是鼓弄是非。一切都摆在眼前，从O2O到共享经济，到无人货架，到人工智能，到区块链。有一群人，他们造风口、造潮流，他们所向披靡，他们出手凶狠。他们赚得盆满钵满、抽身离去，离下多少人负债累累、舔舐伤口。

共享单车，就是这样的一个典型。仅2017年，共享单车企业融资总额就达258亿。它们，给我们带来了什么？把一些年轻人送上巅峰，然后放手让他们自由落体坠下；给一些制造企业带来高潮，待共享单车停摆，急剧减产而暴毙衰歇；给街头巷尾添上五颜六色，而后废铜烂铁、堆积成山。
如此多金，如此代价，也就换了一个摩拜、ofo、哈罗以及正在恢复气血的小蓝，成就了那少数几个人的盆满钵满和人生巅峰。也就换来了个新中国四大发明之一的虚名。

请那煽风点火者，请那推波助澜者，请那拍手称快者，扪心自问：抱着那一辆辆车仔细端详、研究、心想，这是哪门子的新四大发明？
有人会说，这就是商业！那是，我哑口无言。我们的大把社会资金、大量人力物力财力、所有社会的目光，就这样简单的一股脑的聚焦于缥缈的潮流和风口。敢问，人工智能广泛应用的进展怎样了？生态环境、生命科学、航天飞行、疾病灾害这些的创新研究怎样了？
我们在潮流里翻滚，别人在科技软实力上狂奔；我们在朋友圈里表达祖国的强大，人马斯克把私人火箭送上了天。
2018年清明之际，以摩拜投入美团的怀抱为标志，中国共享单车的故事算是正式完结。
伴随着曾经的共享经济热潮，共享单车之后，共享充电宝、共享睡眠仓、共享雨伞，啥都装进了共享这个筐。当然，等待他们的是一个个的倒下。
清明假期，我们再次盘点这些一个个激情至死的亡魂，以让后人警醒、让来者慎重。
一、共享单车：投入超600亿，几乎全军覆没
据电子商务研究中心监测数据显示，2017年共享单车领域融资金额达258亿元。2018年，头部范围的共享单车企业中，ofo3月再融8.66亿美元（近55亿元），摩拜卖给美团计37亿美元（约233亿元），滴滴接管小蓝单车耗资不详。仅对看得见的金额进行统计，加上占用的押金，共享单车累计投入应该会超过600亿元。

2017年共享单车融资统计
随着摩拜卖身美团、阿里加码ofo及投资哈罗、滴滴接管小蓝，共享单车领域的头部公司基本宣布全部缴械成为巨头生态中的一枚棋子。共享单车故事独立讲下去的时代，基本结束。想一想去年那些相继倒闭的第二阵营的公司，卖身或依附巨头对还存活的共享单车公司而言，已经是最好的结局。

2017年阵亡的第二阵营共享单车企业
这些公司能够出现在公众视野，已经算幸运的。更多的共享单车企业，你我甚至还没见过它的颜色、听过它的名字，它们就已经销声匿迹。

二、共享汽车：去年融资近15亿元，前途未卜
伴随共享单车火热，2017年下半年开始，共享汽车也开始受到资本关注。2017年下半年以来，共享汽车融资明显加码。其中，PonyCar、Gofun、TOGO途歌等共享汽车品牌新一轮融资的金额都突破一亿人民币，PonyCar的C轮融资金额更是高达2.5亿人民币。据媒体数据统计，去年共享汽车融资近15亿元。

目前，共享汽车的融资金额远不如共享单车行业多。但共享汽车所需要的资金可能远超过共享单车的需求。共享汽车前期投入的成本要远高于共享单车。因此，受资金限制，规模难以扩大，用户使用的便利程度也不会高。目前，也看不到巨头参与其中。同时，共享汽车的盈利问题，可能更加遥遥无期。此外，共享汽车还面临停车费用高、充电困难等诸多影响用户体验的问题。

去年，就有2家共享汽车宣告寿终正寝。友友用车创始人李宇曾对媒体表示：“共享汽车目前难盈利，费用完全不能打平成本。”尽管有预测共享汽车会是个大市场，如果最终要打出规模，那必将是一场比共享单车投入更大的消耗战。
三、共享充电宝：融资20亿，风口正在销声匿迹
要不是王思聪与陈欧关于共享充电宝“吃翔”的打赌，共享充电宝很多人都不会有特别的关注。即便如此，乘着共享经济东风的共享充电宝也融资达20亿元。去年，该行业还一度创造了“40天达成12亿元融资”的商业奇迹。

而实际上，去年上半年开始，共享充电宝就开始洗牌。伪需求、不符合手机发展趋势、行业混乱，共享充电宝尽管还有的在强撑，它甚至不可能有一个如共享单车一样的未来。

据媒体报道，刚刚到去年底，乐电、小宝充电、泡泡充电、创电、放电科技、PP充电、河马充电等7家企业均已走到项目清算阶段。
四、共享雨伞、共享睡眠仓、共享纸巾，
几乎沦为笑谈
对于共享雨伞，人们最深刻的记忆应该是共享雨伞成为了一门变相买伞的生意。
流传在网络上的段子是这样说的：繁华路段，最近出现了一批共享雨伞，共计3万把，押金19元，半小时收费0.5元。可投放没几天，雨伞就全部被人拿回家！这将是一段经典的营销案例，必将载入中国销售史册！最主要的这还是无人销售。

去年下半年开始，北京、上海、成都等城市出现了“共享睡眠舱”服务，半小时6元，里面有恒温空调、小风扇、Wi-Fi、插座等设备。但因安全隐患和治安隐患等因素，共享睡眠仓几乎都已经被公安部门叫停。
就连衣服也都打起了共享的概念。尽管有报道，有共享衣橱的公司做得风生水起。真的是格局限制了我的想象，真不知道什么样的用户，是要靠租衣过日子的。即便她们会租一阵子，这个生意烧钱和盈利的问题，恐怕也是个大难题。【点此处，看好文，关注新号】

去年11月，号称融资了8000万的多啦衣梦共享租衣APP显示无法正常运营，页面呈空白状态。面对退钱要求，多啦衣梦抛出一句话：“要钱没有，用衣服来抵。”其失败根源，无非是用户对共享租衣的需求并不刚性、盈利模式不清晰、服装和快递等成本巨大。
接下来，甚至还出现了共享电脑、共享手机......共享几乎成为了各行各业的一剂“春药”，短暂的激情过后，必然是萎靡不振甚至一败涂地。
据中国电子商务研究中心(100EC.CN)发布《2017年度中国共享经济发展报告》显示，截至2017年12月，共有190家共享经济平台获得1159.56亿元投资。该研究中心助理分析师陈礼腾认为，2017年共享经济行业存三大痛点：一是行业同质化现象严重缺乏创新。二是商业模式不清晰。三是资源掌控能力不足。
同时，该研究报告还指出，2017年中国共享经济市场规模约为52850亿元。
但是，无论共享经济领域涌入了多少投资、市场规模有多大，摆在我们面前的恐怕还是：看似大而美的市场，能够有效的整合成清晰的商业模式吗？能够带来一个个行业真正的繁荣嘛？
到今天，我们看到的却只是：投进去1000多个亿，最好不过一个滴滴，以及只能委身巨头的摩拜、ofo及哈罗们。如果要说，我们的共享经济，除了发明了一种新的抢夺市场方法论外，很难找到它们给中国的科技、社会带来了怎样的创新和改进。

有这么一个段子，大概能够表达此刻我内心最想说的话：
中国受过极良好教育的年轻人们，聚焦在被称为“创业导师”的中年男人们周围，一起彻夜不休地燃烧生命，只为在一轮又一轮如何送菜送饭、洗车洗脚、美容美甲、搭讪艳遇、借高利贷、联结窗帘和电冰箱的挑战赛中博出更好的名次，然后击鼓传花，快速传给下一棒......大西洋和太平洋彼岸很多巨头公司的创始人，他们在骨子里并不是商人，而是geek。热衷于创造新奇的事务，热衷于解决难题，热衷于在某个极细分的产品上把质量和性能或功能做到极致，这是geek的天性......科技，在这一刻，非常残忍的拉开了国与国之间的差距。
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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线? 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNAforward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcacggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggtggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216acgcagtaatctcagctggtggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggtgtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67agcagacaacctgcttgaatgggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactgaccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10gcagtaccctgtagatccgaaggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaaggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2cagacactgcgatctattgaggtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31gagctgcctgatgaagagtccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNAUnique RNAsPercent (%)Total RNAsPercent (%) Total39,8131006,194,289100 rRNA 11,262 28.29 1,048,53816.93 tRNA2,1245.33 22,2890.36 snoRNA190.05 1830.00 other10,26425.78127,975 2.07 miRNA 16,14440.55 4,995,30480.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID)miRanda RNAhybrid ConservedNovelConserved Novel gst-pi(AY885667.1)miR-315, miR-8a, miR-8bNovel-30, Novel-38 miR-277Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2cNovel-40miR-1992, miR-2b, miR-34,Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2)miR-10, miR-1992, miR-315Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1)miR-1985, miR-315, miR-7,miR-7, miR-981Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1oC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA16μL DNaseⅠ2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如下： （1）在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA，2μg随机引物和去离子水一共15μL，在金属浴中加热离心管到70℃，5min，这样可以打开模板的二级结构。然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构，短暂离心，使溶液归于管底； （2）按照下列表格的顺序和比例在上个步骤的离心管中加入反应体系的各个组分： M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液1.25μL Rnasin核酸酶抑制剂25Units0.75μL M-MLV Reverse Transcriptase 200U1μL 无核酸水2μL Total volume25μL 轻弹或短暂离心混合溶液。37℃孵育60min进行反转录反应，然后在-20℃保存。 3.2.3.4. 3′和 5′RACE cDNA模板的合成 利用 SMART TM RACE Amplification Kit (Clontech）合成 RACE 模板。 （1）Buffer Mix 5×First-stand Buffer 4μL DTT(100mm）0.5μL dNTP Mix(20mm）1.0μL Total volume5.5μL （2）5′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA2μL 5′-CDS primer A1μL Sterile H2O8μL （3）3′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA2μL 3′-CDS primer A 1μL Sterile H2O9μL （4）（2）和（3）两离心管中的混合物分别混匀，短暂离心。 （5）72°C 下加热3min，然后42°C 下保温2min；在冰中冷却2min后 14000g离心10s。 （6）向5′RACE cDNA中加入1μL SMARTerⅡA oligonucleotide，轻微振荡后短暂离心。 （7）室温下混合以下试剂： Buffer Mix5.5μL RNase inhibitor0.5μL SMART Scribe Rererse Trancriptate(100U）2μL Total volume8μL （8）向上述混合液中分别加入（6）中的 5′RACE cDNA 和（3）中 3′RACE cDNA，终体积为 20μL。 （9）轻微振动离心管瞬时离心，42°C孵化90min，之后于 72°C下保温 10min。 （10）加入90μL Tricine-EDTA Buffer对RACE cDNA库进行稀释，cDNA库在-20°C可保存三个月，或在-80°C长期保存。 3.2.4河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.2.4.1 3'RACE和5'RACE cDNA 扩增 根据本实验室转录组测序所得的CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因序列片段, 设计3'和5'RACE 特异性引物，引物设计采用 Primer Premier 5.0 软件进行， 所设计的引物由上海生工生物公司合成（表4-1）。 表3-1 基因克隆与荧光定量 PCR 所用引物序列 Primer namePrimer sequence (5’→3’） Application CCK-F GAACAAGCAGAATGACGGqPCR CCK-RACTCTTCGCCCTTTTACC Conopressin-F TCACTACATCGGTGACTATAA Conopressin-RATGTTCAGAGTTCATATTGGGFFamide-F TACCGCTATCGCAATCTT FFamide-R GAAAAGGTTTAAGACATCAUPM CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA ACGCAGAGT Universal primer CCK3F1 ATGCGTCCTCTTTTGTCAGC3’RACE PCR CCK3F2TCCTGGGATTATGATTACGG Conopressin3F1 GCTACCAACTGATTTCTCTATTConopressin3F2GGTCTAAATGGGCAGCCGTGTTFFamide3F1 CCTACGACGACGAAGAAATFFamide3F2AGAGCTATCTGGCGCTAGCAGACCK5R1AGGACGCATATTAACTTCTG 5’RACE PCR CCK5R2AACTCGCGGTCATTTGCACTConopressin5R1TCCGGTCAGCAAAACAAAGTConopressin5R2 GTCTTGGTATGCCTAGTATTFFamide5R1TCACACATTTCTTCGTCGTCFFamide5R2CTGTTCATGTTGGGGCTCAC CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的3'和5'引物(表 3-1）分别与通用引物UPM配对，利用SeqAmp? DNA Polymerase进行3'端和5'端扩增。反应体系为： 3'或5' RACE cDNA库2.5μL 10×UPM5μL 3'或5' GSP(10μM）1μL PCR-Grade Water 15.5μL 2×SeqAmp? Buffer25μL SeqAmp? DNA Polymerase1μL Total volume50μL 将上述体系轻微振动混匀，瞬时离心，放入 PCR 仪中进行以下反应： 反应程序： 95°C 预变性3min 95°C30s 72°C3min 循环5 94°C 变性 30s 68°C 退火30s 72°C 延伸3min 循环25 72°C 延伸10min 4°C 保存For ever 取 2μL 反应产物，在 1.5% 的琼脂糖凝胶上进行检测，恒定电压为 120V, 电泳时长为 30min。 3.2.4.2 PCR 产物的分离与回收 根据电泳结果，使用Gel Doc XR+凝胶成像仪在紫外环境中给条带曝光，然后将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下。胶回收纯化过程基本操作如下： （1）将切下的凝胶块放入 1.5mL 离心管中，每100mg凝胶加300-600μL Buffer B2。 （2）于50°C加热5-10min，其间晃动2~3min至离心管中凝胶全部溶解。 （3）将上述溶化的凝胶液全部移入吸附柱，8000g离心30s，将收集管中的液体倒掉，吸附柱重新放回收集管中。 （4）向吸附柱中加入300μL Buffer B2，9,000g 离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 （5）向吸附柱中加入 500μL Wash Solution，9000g离心 30s，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。 （6）重复步骤（5）一次。 （7）将空的吸附柱和收集管放入离心机中，9000g 离心 1min，室温下晾晒 5min。 （8）扔掉收集管，将吸附柱放到一个新的离心管中，向吸附膜中央加入 15μL Elution Buffer，室温放置 1~2min，9000g离心1min，收集 DNA 溶液， 该溶液可于-20°C 保存。 （9）将离心得到的DNA溶液重新加回吸附柱中，重复步骤（8），以提高DNA的回收量。 （10）琼脂糖凝胶电泳检测回收情况。 3.2.4.3 扩增片断连接并导入大肠杆菌细胞 使用pMD20-T Vector（TaKaRa）试剂盒将回收的DNA片断与T载体相连接， 连接反应体系如下： pMD20-T1μL 纯化的DNA片断1μL 无核酸水3μL Solution Ⅰ 5μL Total volume10μL 16°C 反应30min。 质粒转化 （1）取 100 μL 感受态细胞（JM109）在冰水中融化。 （2） 取10 μL 已转入目的片段的载体与感受态细胞溶液相混合，将混合物混匀，放置于冰上 30 min。 （3）在42°C水浴锅中热激45 s，立即放置于冰上冷却1min. （4）向离心管中加入890μL SOC无 AMP 液体培养基，吹打混匀，37°C下 于振荡培养箱中200 rpm培养60 min。 （5）室温下，4000rpm离心4min，将部分上清液吸出，剩下200μL 左右，吹打重新使细胞悬浮。 （6）将7 μL 20 mg/mL的IPTG和40 μL 20mg/mL 的X-Gal加入到含有AMP的平板培养基上，涂布均匀，然后加入100 μL的菌液，用涂布环（事先用酒精灯烧，放皿内侧冷却）涂平板。 （7）在37°C 恒温培养箱中正向培养1个小时，之后倒置培养过夜（12-14h）。 筛选阳性克隆 （1）按照1000:1的比例在 LB 液体培养基中加入AMP，混匀，向1.5 mL离心管中加入1 mL含有AMP的LB液体培养基，然后用无菌牙签从培养平板中挑取10个白色单菌往每个离心管中轻蘸几次，放入37°C振荡培养箱中200rpm培养6-8h。 （2）选择M13引物对阳性克隆进行PCR筛选，PCR 反应体系如下： GoTaq? Green Master Mix, 2X12.5μL 菌液2μL M13-F（10 μM）1μL M13-R（10 μM） 1μL 无核酸水8.5μL Total volume25μL 用移液枪轻轻吹打，使 PCR 管中样品混匀，用小离心机进行瞬时离心，使样品聚于管底，之后进行 PCR 扩增，反应参数如下： 95°C预变性5min 95°C变性 30s 58°C退火30s 72°C延伸1min 循环数30 72°C延伸10min 4°C保存For ever （3）取5μL PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，选择目的条带清晰的菌液进行测序。 3.2.5 序列分析 使用Bioedit软件对测序结果进行载体序列去除和序列拼接，使用Expasy ()预测开放阅读框(ORF)并翻译成氨基酸。使用DNAMAN7对CCK, Conopressin和FFamide基因的氨基酸序列进行同源性分析，运用PrediSi ()对信号肽进行了预测。 3.2.6 CCK, Conopressin and FFamide在不同组织中的相对定量分析 根据河蚬β-actin基因和克隆所得的CCK, Conopressin and FFamide基因序列, 设计了定量PCR引物 (附录5)，进行相对基因表达量的检测。按照前述提取河蚬不同组织(包括内脏团、鳃、腹足和外套膜)的RNA并反转录合成cDNA。使用了Promega公司的Master Mix预混液，按照比例配置扩增体系。扩增体系总体积为20μL，其中PCR反应液包括10μL定量PCR Master Mix、0.4μL（200nM）正向引物、0.4μL（200nM）反向引物、2μL（100ng）cDNA模板，加无核酸水至20μL。PCR反应使用7500 Real-Time PCR system，程序为预变性95℃，5min；40个循环：95℃ 15s，55℃ 30s，72℃ 30s；最后一个循环做出熔解曲线：95℃ 30s，57℃ 30 s，72℃ 60s，为了确定产物的唯一性和实验的有效性。每个样品三次重复。内参基因为β-actin[41]，目的基因的相对表达量根据2–ΔΔCt法计算[166]。实验的数据均通过SPSS 16.0进行数据分析。结果均表示为平均值±标准误差（means±SEM），实验组与对照组间差异分析用one-way ANOVA，差异显著性用Levene’s和LSDt-test检验，显著性水平为p<0.05。柱状图使用作图软件Orign 8.0完成。 3.2.7 4种有机磷酸酯暴露下CCK, Conopressin and FFamide基因表达变化 河蚬的暴露采用半静水法，暴露容器为圆柱形玻璃缸，暴露液溶剂为5L，亚慢性暴露时间为30d，暴露期间保持环境条件稳定，并喂食人工培养的绿藻或纱绢过滤的螺旋藻粉，具体暴露条件和规范见附录2。 毒性暴露时，选取体型大小相似、健康无伤的河蚬，平均体长15mm左右，随机放入各实验组，每个实验组30只。暴露组浓度设空白对照，20μg/L，200μg/L，2000μg/L的TDCPP，TBP，TBEP和TCEP，每组三个平行。对处理完毕的不同浓度暴露后内脏团组织样品进行总RNA提取，并反转为cDNA，以β-actin基因作为参照基因，反应体系和程序如 3.1.5，检测不同浓度TDCPP，TBP，TBEP和TCEP对河蚬内脏团CCK, Conopressin and FFamide基因表达量的影响，数据处理及分析同3.2.5。 3.3结果与分析 3.3.1 河蚬CCK, Conopressin and FFamide基因的cDNA克隆与序列分析 将测序获得的cDNA序列进行拼接分别得到河蚬CCK，Conopressin和FFamide基因全长（图3-1）。全长分别为1239 bp, 1352 bp和679 bp，其中5‘-UTR(非编码区)长分别为为413 bp，452 bp和85 bp，开放阅读框(ORF)长分别为522 bp，459 bp和273 bp，3’-UTR(非编码区)长分别为304 bp，441 bp和321 bp, 其中包括一个终止密码子，多聚腺苷酸加尾信号(Polyadenylation Signal Site)(AATAAA)和PolyA尾。 氨基酸序列分析表明，CCK神经肽由17个氨基酸组成，推导的分子量为19.18kDa。河蚬CCK神经肽与其他非脊椎动物多序列比较结果显示CCK氨基酸序列保守性低。例如与珍珠贝同源性为27.37%，与海蜗牛同源性为26.82%，与牡蛎同源性为22.35%。CCK的多重比对揭露了C末端的DYGLGGGRF在所选取的序列中完全保守（图3-2）。Blast和ClustalW分析显示Conopressin与大海鹿和海兔的同源性为42.20%，与牡蛎和珍珠贝的一致性分别为41.62%和38.15%。在这些物种中，N末端的CFIRNCP序列和C末端的GICCD序列是完全保守的。推导的FFamide氨基酸序列通过BLAST and ClustalW分析得出与双壳贝类更加保守，例如珍珠贝（31.73%），牡蛎（29.81%），但在其他软体动物中保守性低一些，如耳鲍（27.88%），玄妙微鳍乌贼（24.04%）。在这五个物种中发现NSLFF为高度保守序列。 图3-1 CCK, Conopressin and FFamide神经肽基因cDNA全长克隆序列和前体氨基酸序列 推导的氨基酸序列在核苷酸序列下方显示，推定的信号肽序列下面画黑色线，预测的神经肽成熟体标为红色并下划线，预测的运载蛋白标为紫色，基本剪切位点标为绿色，半胱氨酸残基蓝色，C末端酰胺化的甘氨酸标为橙色。 图3-2 河蚬CCK, Conopressin and FFamide神经肽基因前体氨基酸序列与其他物种的多重比对。在所有物种都保守的残基全标黑，只有一个不保守的全标灰色。使用的其他序列来源如下： CCK: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, scaffold3913.1|size60815pfu); 牡蛎C. gigas (EST CU986686, EST CU993470); 海蜗牛A.californica (XP_005096263.1). Conopressin: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, pfudmixc42469g19050 IsotigID scaffold414176.1:1..292); 牡蛎C. gigas (EST AM854257.1(A)/FQ666404(C)); 海蜗牛A.californica (ACN24615.1); 静水椎实螺L. stagnalis(AAB35220.1);大海鹿A. kurodai(BAB40371.1). FFamide: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, scaffold38094.1);牡蛎C. gigas (CU987867); 耳鲍H. asinina (EST GD272468.1); 玄妙微鳍乌贼I. paradoxus (EST DB917831.1). 3.3.2 CCK, Conopressin, and FFamide基因组织分布 利用荧光定量PCR分析了河蚬CCK, Conopressin, and FFamide基因在不同组织中的表达水平，结果表明（图3-3），CCK基因在内脏团中表达量最高，接着是外套膜，鳃和腹足。而对于Conopressin，除了在内脏团中表达量最高外，在鳃，腹足和外套膜中表达量都比较低。而FFamide在腹足和外套膜中极少表达除了内脏团和鳃。 图3-3 CCK, Conopressin和FFamide神经肽在河蚬内脏团、鳃、腹足和外套膜中表达量 3.3.3 4种有机磷酸酯暴露后CCK, Conopressin和FFamide基因表达量在内脏团中的变化 使用荧光PCR 检测了20, 200和2000 μg/L浓度的TDCPP，TBP，TBEP和TCEP 30天暴露后河蚬内脏团中CCK, Conopressin和FFamide基因相对表达量的变化（图3-4）。结果表明，200和2000μg/L的TDCPP暴露组使CCK基因表达量与对照组相比上调了2.12和2.09倍，显著性提高，而20μg/L暴露组对CCK表达没明显影响。TBP暴露组随着浓度升高，CCK表达量逐渐提高（200μg/L，2.43倍；2000μg/L，4.37倍），20μg/L处理中无明显变化。TBEP的所有浓度暴露组与对照组相比都显著上调CCK表达水平，分别升高了2.48倍，3.34倍，3.09倍。而TCEP暴露组对CCK表达水平没明显影响。4种有机磷酸酯只有TCEP暴露组显著上调了Conopressin基因相对表达量（20μg/L，2.77倍；200μg/L，2.68倍；和2000 μg/L，3.19倍）。FFamide表达水平都受到了4种有机磷酸酯的显著性诱导（p<0.05，图3-4），其中都是200μg/L处理组上调最高，呈现倒U型。 图3-4 四种有机磷酸酯对CCK神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 图3-5 四种有机磷酸酯对Conopressin神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 图3-6四种有机磷酸酯对FFamide神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 3.4结果讨论 3.4.1河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆及序列分析 目前对神经肽基因的研究主要集中于脊椎动物和海洋软体动物，双壳贝类特别是我国淡水双壳贝类神经肽研究仍是一片空白，本研究首次克隆河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因 , 这3个基因全长分别为1239 bp, 1352 bp和679 bp，包括522 bp，459 bp和273 bp开放阅读框，分别编码173，152和90 个氨基酸，分析了这3个神经肽氨基酸序列的特征并用Blast和ClustalW与其他非脊椎软体动物进行了比对，发现CCK, Conopressin和FFamide神经肽的保守性在22.35%到42.20%之间，保守性较低，CCK具有DYGLGGGRF保守氨基酸，Conopressin神经肽N末端的CFIRNCP序列和C末端的GICCD序列是完全保守的，发现NSLFFN是FFamide神经肽的高度保守序列。在脊椎动物中CCK涉及到胰腺液的分泌[167]，在非脊椎动物中CCK 在结构和功能上与胃泌激素有关，都是调控消化和进食[47]，CCK的生物活性肽区域(QGSWDYDYGLGGGRF-NH2 and AKSYGDYSLGGGRF-NH2)与其他非脊椎动物非常保守. 第一个确定的Conopressin神经肽在结构上与vasopressin相关，在杀手芋螺的毒液中发现[71]并且报道称在静水椎实螺中起到调控性行为的作用。在结构上，紧接着信号肽后面的是N末端Conopressin成熟体，序列是CFIRNCPPG-NH2，而毗邻C末端的神经垂体素包含14个半胱氨酸残基后面紧接着一个未剪切的和肽素同源区域。FFamide首先在静水椎实螺[168]，帽贝[169]和比萨茶蜗牛[169]中发现，在结构上与节肢动物SIFamide神经肽类似[170]。突出了典型的软体动物FFamide神经肽前体的结构特征，即包含一个信号肽，通过在二碱基位点剪切出的2个FFamide成熟体序列。据报道，FFamide与果蝇输精管精子运输有关并且调控性行为[171]。在河蚬中，2个推定的FFamide生物活性区域是DEGYSRLVQQKPLLFamide和GVSPNMNSLFFamide。 3.4.2 CCK, Conopressin, and FFamide基因组织分布分析 河蚬CCK, Conopressin, and FFamide基因在各组织中都有所表达，在脊椎动物中，CCK在脑中的表达非常丰富[47, 78]。在比萨茶蜗牛中，Conopressin很清楚的在胰腺，腹足肌肉，阴茎，卵精巢和和射囊中鉴定出来[56]。尽管之前的研究发现软体动物神经肽主要在中枢神经系统[47]或神经器官[172]表达，但河蚬非常小很难将神经系统从其他组织分离出来，并且还没有河蚬神经系统的报道。内脏团，鳃，腹足和外套膜经常被用来分析河蚬基因的组织分布[173-175]。从组织表达的结果来看，3个神经肽都在内脏团中表达量最高。内脏团是一个包括许多器官的混合组织，河蚬神经系统可能包含于其中。而其他3个组织是单一并明确的，有限或没有神经系统在这些组织，因此CCK，Conopressin和FFamide神经肽的表达水平与在内脏团中相比很低或几乎没有。 3.4.3 4种有机磷酸酯暴露后CCK, Conopressin和FFamide基因表达变化分析 河蚬因其广泛的地理分布，与底泥直接接触而作为一个很合适的淡水环境检测物种[132, 176]。在目前研究中，我们使用河蚬内脏团中CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因表达的变化来评估TDCPP，TBP，TBEP和TCEP慢性暴露的影响。这四种典型的有机磷酸酯广泛的在阻燃剂和塑料工业中使用[88, 89, 177, 178]。目前还没有文献报道环境污染物暴露对脊椎和无脊椎动物CCK，Conopressin和FFamide表达的影响。文献报道了HgCl2比ZnCl2更能影响到gastrin/CCK8的行为和免疫反应[70]。 在我们的结果中200μg/L和2000μg/L TDCPP暴露下，CCK基因相对表达量显著上调，并且上调倍数一直，说明CCK表达对这两个浓度的TDCPP暴露敏感，而20μg/L TDCPP暴露组对CCK表达无明显效应，说明CCK表达对该浓度TDCPP不敏感。TBP对CCK表达呈现出剂量-效应关系，浓度越高，诱导效应越强，CCK表达可以很好的反应不同浓度TBP暴露的影响，表明CCK是TBP潜在的生物标志物，TBP被认为具有神经毒性[179]，而CCK是神经元细胞分泌的信号传递物质，可能TBP对河蚬神经系统有损伤并诱导了CCK的大量分泌。同样TBEP从低浓度到高浓度对CCK表达都有明显诱导效果，但文献关于TBEP的毒性报道十分有限，CCK对TBEP的敏感性比其他几个有机磷酸酯都要高，其具体影响机制还需要更深入的研究。不同浓度TCEP暴露对CCK表达水平没有明显影响，文献报道[108, 180]长时间的TCEP暴露后，大鼠大脑出现萎缩退化并有癌变效应，在这里CCK可能不是TCEP的作用靶点，CCK对TCEP也不敏感。 不同浓度的TDCPP，TBP和TBEP暴露对Conopressin表达没有明显效应，但TCEP的所有浓度都能引起Conopressin的显著性上调，结果表明Conopressin能很灵敏的指示TCEP的暴露影响，是TCEP的潜在生物标志物。 而FFamide神经肽基因相对表达量对不同浓度的4种OPFRs都呈现出倒U型，都是显著性上调，在20μg/L和200μg/L浓度下，随着浓度升高，FFamide相对于对照组表达量也越高，但在2000μg/L浓度下效应下降，可能是FFamide神经肽表达很容易受到有机磷酸酯的影响，在高浓度超过了分泌FFamide神经元细胞的能力，反而不如200μg/L处理组诱导效应高。之前有文献报道河蚬经常在3.13 mg/L 毒死蜱暴露下关闭双壳[9]. 河蚬闭壳的现象也曾在水中金属暴露下有过报道[181]。高浓度OPFRs暴露下河蚬可能通过闭壳来保护自身。四种OPFRs都对FFamide产生类似效应更加印证了，FFamide能很好的标志OPFRs的影响。 3.5 本章小结本章通过RACE技术克隆了CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因的全长序列，运用生物信息学软件分析了这些全长序列，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。主要结论如下： 1、CCK, Conopressin和FFamide神经肽具有典型的软体动物神经肽特征，在不同组织的表达情况反映了神经细胞的分布。 2、TDCPP、TBP和TBEP对CCK神经肽基因都有不同程度上调影响，CCK基因可作为这3种有机磷酸酯的潜在标志物。仅有TCEP对Conopressin有显著诱导作用，而对CCK没有明显效应，可作为区别TCEP与其他污染物的标志物。4种OPFRs对FFamide都有显著效应，呈倒U型，表明FFamide能很灵敏的应答这4种标志物，高浓度的暴露效应下降，可能是降低了河蚬的健康水平，使其机能下降。 ? 第四章 有机磷酸酯TDCPP和TBP对河蚬毒性效应与作用机制研究 4.1 引言 目前，有机磷酸酯阻燃剂在生活生产中大量使用，而其对人和动物的毒理学效应还不是很清楚，本研究使用RNA-seq技术探究了TDCPP和TBP暴露后，河蚬转录组数据的变化，并对河蚬行为学指标，基因表达变化和酶活性进行了验证。 4.2 材料与方法 4.2.1 实验材料 磷酸三（1,3-二氯异丙基）酯（TDCPP，CAS:13674-87-8；纯度﹥98%）； 中性红溶液（浓度为1 mg/L）； 磷酸三丁酯（TBP，CAS:126-73-8；纯度﹥98%）； 其中，由于有机磷酸酯不溶于水，将2种有机磷酸酯溶于丙酮并储存于棕色试剂瓶中，置于4℃冰箱中备用；中性红现配现用。 4.2.2 毒性暴露实验 暴露实验详见附录4。毒性暴露时，选取体型大小相近、健康无伤的河蚬，平均体长20.47±2.15mm左右，随机放入各实验组，每个实验组30只。暴露组浓度设空白对照，20μg/L，200μg/L，2000μg/L，每组三个平行。暴露阶段结束后采集河蚬的内脏团组织并提取蛋白和RNA于-80℃保存。 4.2.3 河蚬行为学指标测试 参照国内外文献中贝类行为学研究的方法，建立了能够应用到水生态毒理学中的河蚬行为学指标——虹吸作用的测试方法。 方法如下：河蚬生活在水底，靠进水管和出水管过滤水中的食物为生，国外很早就有研究，利用河蚬的虹吸作用指标来监测水体中的环境污染物。本方法主要基于Cooper和 Bidwell（1996）的方法，在其方法的基础上进一步改进。暴露实验结束后，分别取空白组和暴露组各个组河蚬5只，立即放入盛有100mL中性红溶液（浓度为1mg/L）的烧杯中，使用分光光度计测定此时在530nm处的吸光值；2h以后再测定吸光值，根据以下公式计算河蚬的虹吸效率m（mL/animal/h）。 公式： ，（4-1） 注：M为测试溶液的体积，n是河蚬的数目，t为测试时间，c0 为开始测试时溶液的吸光值，ct为测试结束时溶液的吸光值。 4.2.4 河蚬生化指标测试 河蚬的生化测试指标包括河蚬内脏团组织中Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的酶活性。在测定之前，需要提取河蚬各个组织的蛋白，具体操作流程和步骤如下： 4.2.4.1蛋白提取 河蚬蛋白提取的方法，具体步骤如下： （1）取50-100mg内脏团组织于1.5mL EP管中，加入200μL裂解液I（30 mM Tris，2M硫脲，1% w/v DTT，7M尿素， 4% w/v CHAPS，蛋白酶抑制剂），置于冰上，用电动研磨器研磨充分。 （2）在研磨后的溶液中补充加入400μL裂解液I，混匀后置于冰上，间隔超声，功率80-100W，超声5s，冷却10s，共进行10个循环。 （3）4℃，12000×g离心10 min，取上清，避开上层油脂。 （4）每份样品取3μL用于蛋白定量，定量步骤按2-D Quantity kit（GE Health）试剂盒说明进行。 （5）根据测得的蛋白浓度，将每份样品用裂解液稀释到3mg/mL。放于-80℃中备用。 4.2.4.2 Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9酶活性测定 本实验测定了河蚬内脏团Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的酶活性，均采用购自碧云天生物技术研究所（中国江苏）的相应试剂盒按照说明步骤进行测定，具体方法如下： Caspase 3酶活性的检测： 1. 准备工作： a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 b. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 2. 测定pNA标准曲线： a. 标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。 b. 将试剂盒中的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。 c. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，测定A405。 d. 用每一个标准品的A405减去空白对照的A405计算出吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。 3. Caspase 3酶活性的检测： 将试剂盒中的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰上融化。 如下设置反应体系： 空白对照样品 检测缓冲液40μL40μL 待测样品0μL50μL 裂解液50μL0μL Ac-DEVD-pNA (2mM)10μL 10μL 总体积100μL100μL c. 加完试剂后，将混合液在37oC保温60分钟。测定样品的A405。 d. 将样品的A405减去空白对照的A405，即为样品中Caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过标准曲线的计算就可以产生了多少量的pNA。 Caspase 8酶活性的检测： 试剂采用Caspase 8试剂盒，其他反应体系和步骤同Caspase 3 Caspase 9酶活性的检测： 试剂采用Caspase 9试剂盒，其他反应体系和步骤同Caspase 3 4.2.5 文库构建与测序 4.2.5.1 总RNA提取与质量鉴定 暴露实验结束后，分别提取空白对照组和2000μg/L TDCPP和2000μg/L TBP暴露组河蚬内脏团组织总RNA，为了获取尽可能多的转录本信息，我们采用混合样的方法，取样之前，停止喂食一个星期，取壳长20.47±2.36mm的成年河蚬5只，分别提取内脏团、鳃、腹足和外套膜等组织，进行总RNA提取，对总RNA纯化和鉴定后等比例混合。提取采用Trizol法。使用QUBIT2.0光度仪和安捷伦Agilent 2100 Bioanalyzer 进行RNA浓度和质量测定，将RIN≧8且260/280nm光度比值≧1.8的RNA进行下一步建库和上机测序。 4.2.5.2 建库与测序 (1) mRNA纯化与片段化。取4μg总RNA建库，用带有 Oligod(T)的 Beads 对 Total RNA 中 mRNA 进行纯化，然后选择合适程序对mRNA进行片段化； (2) cDNA合成与末端修复。使用Second Strand Synthesis Enzyme Mix和合适程序进行cDNA合成，并在3’端加A； (3) PCR扩增与产物富集。使用合适程序进行PCR使文库产物富集，将产物电泳后切胶纯化。 (4) 文库质控。使用 2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 判断 PCR切胶产物片段大小是否符合后续测序的要求； (5) 混合文库。根据文库的定量及定性结果将每个 library 的摩尔浓度统一调整到 2nM，然后根据实验设计选择性的将需要混合的 library 进行等量等浓度混合，保证混合后的 library 的终浓度也是 2nM，体积大于等于 10 μL ，然后将文库进行-80℃保存。 (6) 上机测序。使用Illumina平台进行双向测序，得到测序数据。 4.2.6 转录本生物信息学分析 对测序得到的原始 reads（双端序列）进行过滤后，将高质量的 reads进行转录本的组装，对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上，再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析。 4.2.6.1测序数据过滤及统计 对原始数据进行过滤，使用 ngsQCToolkit-2.3.3 2 软件过滤掉低质量 reads 和有引物污染的 reads。 4.2.6.2 转录本组装 使用 Trinity 3 对 clean reads 进行组装，Trinity 利用 de Bruijn graph path 算法对 reads进行 denovo 拼接。得到组装后的 Unigene Library（Trinity.fasta），过滤掉外显子总长低于 200bp 的转录本后，得到一个最终的转录本序列文件。 4.2.6.3功能注释 使用 blast 软件将转录本序列与各主流数据库(Nt，Nr，GO，KEGG，Swiss-Port)进行比对；利用 HMMER 7 进行蛋白质结构域预测；signalP 8 进行信号蛋白预测；tmHMM 进行跨膜区域预测，最后利用Trinotate 整合注释结果。 4.2.6.4表达量分析 在 RNA-seq 分析中，我们可以通过定位到基因组区域或基因外显子区的测序片段（Fragment，一条 fragment 指一对 reads 所在的序列片段）计数来估计基因的表达水平。Fragment 计数除了与基因的真实表达水平成正比外，还与基因的长度、测序深度成正相关。为了使不同基因、不同实验间估计的基因表达水平具有可比性，引入 FPKM 9 的概念，FPKM （Fragments Per Kilo bases per Million fragmentss）是每百万测序片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目。FPKM 同时考虑了测序深度和基因长度对 reads 计数的影响，是目前最为常用的基因表达水平估算方法。